Onder keizer1) speelde Praag een belangrijke rol. Rudolf koos de stad als residentie. De stad bloeide op als cultureel en politiek centrum van het Habsburgse Rijk. Rudolf garandeerde vrijheid van godsdienst en bracht dit ook in de praktijk. Hij bekommerde zich echter weinig om staatszaken en werd in 1611 gedwongen Hongarije en Oostenrijk aan zijn broer Matthias af te staan. Wel wist hij de Boheemse kroon te behouden. Rudolf wees zijn neef Leopold als zijn opvolger op de Boheemse troon aan. Leopold was te ambitieus om Rudolfs dood af te wachten en greep meteen de macht. Hij werd echter vrij snel door Matthias verslagen. Rudolf werd krankzinnig en stierf niet lang daarna. Matthias werd overvleugeld door de fel katholieke Ferdinand II.

In 1618 kwamen de Tsjechische edelen in opstand tegen Ferdinands antiprotestantse praktijken. Op 23 mei 1618 werden twee impopulaire keizerlijke stadhouders als symbool van de Habsburgse overheersing uit een raam van de Praagse Burcht gegooid. Zij overleefden de val omdat ze op een mesthoop terechtkwamen. Deze daad staat bekend als de Tweede Praagse Defenestratie en vormde de directe aanleiding tot het uitbreken van de Dertigjarige Oorlog (1618-1648). De dood van koning Matthias in 1619 maakte de zaak niet eenvoudiger. De Tsjechen zetten Ferdinand als koning van Bohemen af en kozen in zijn plaats de calvinist Frederik V van de Paltz als vorst, in de hoop dat hij tot keizer zou worden gekozen. Ferdinand II (1620-1637) viel echter die eer te beurt. Hij viel Bohemen binnen en rukte op naar Praag. Frederik probeerde hulp te krijgen van bevriende vorsten. Zijn neef prins Maurits der Nederlanden vreesde echter een burgeroorlog in zijn eigen land en de Engelse koning Jacobus I, Frederiks schoonvader, was net bezig een huwelijk te arrangeren tussen zijn zoon en een Spaanse prinses.

Op 8 november 1620 werden de Tsjechische protestanten onder leiding van Frederik door de keizerlijke legers verpletterend verslagen in de slag op de Witte Berg. Ferdinand liet op 21 juni 1621 27 leiders van de opstand op het Oudestadsplein te Praag onthoofden. De bevolking kreeg de keus. Zij konden zich tot het katholicisme bekeren of het land verlaten. Het merendeel van de adel, de intelligentsia en de geestelijkheid verliet het land. Hun bezittingen (75% van de Tsjechische bodem en de horige boeren) werden verdeeld over adellijke – vaak Duitstalige – Habsburgse aanhangers. Het Tsjechisch werd steeds meer de taal van de ondergeschikten. De Tsjechen bleven zich echter verzetten. In het buitenland ontstond een anti-Habsburgse coalitie, die bestond uit Denemarken, de lage landen, Engeland en Neder-Saksen.

In deze tijd (1625) accepteerde Ferdinand het aanbod van de legendarische veldheer Albrecht von Wallenstein om een keizerlijk leger samen te stellen. Wallensteins macht nam zodanige vormen aan dat Ferdinand hem in 1630 uit angst ontsloeg. Invasies door de Zweden en de Saksen brachten Wallenstein weer terug als legeraanvoerder. Ferdinand bleef echter aan hem twijfelen en liet hem in 1634 vermoorden (zie ook onder Cheb). In 1646 probeerden de uitgeweken Tsjechen met behulp van Zweden, Bohemen en Moravië zich te bevrijden van de Habsburgse overheersing. Hun landgenoten waren echter inmiddels bekeerd tot het katholicisme en namen de wapens tegen hen op. De uitgeweken Tsjechen werden uiteindelijk verslagen. De rooms-katholieke kerk zou weer de grootste kerk worden.

In de eeuw die volgde was het betrekkelijk rustig in Bohemen. Onder de opeenvolgende keizers Leopold I (1657-1705), Josef I (1705-1711) en Karel VI (1711-1740) maakte Praag vooral grote ontwikkelingen op cultureel gebied door. In die periode werd Wenen steeds meer het centrum van de Habsburgse macht. Het nationalisme en protestantisme werden onderdrukt. De jezuïeten moesten er opnieuw voor zorgen dat de bevolking katholiek werd. In 1740 stierf keizer Karel VI. Omdat hij geen mannelijke opvolgers had, besteeg zijn dochter Maria Theresia (1740-1780) de troon. Zij werd echter door de Tsjechische adel niet geaccepteerd. De Tsjechen probeerden zich van de Habsburgers te bevrijden door de keurvorst van Beieren, Karel Albrecht te steunen toen hij aanspraak maakte op de Habsburgse erfenis. Maria Theresia wist zich evenwel te handhaven. In 1749 werd een decreet uitgevaardigd waarin bepaald werd dat de Tsjechische en Oostenrijkse kabinetten in één centrale regering zouden opgaan. Hongarije zou niet onder dit gezag vallen. Hier werd in feite een begin gemaakt met de toekomstige Oostenrijks-Hongaarse dubbelmonarchie. In

1780 besteeg de Habsburger Josef II (1780-1790) de troon. Hij perkte de macht van de katholieke kerk in en keurde godsdienstvrijheid goed. In 1781 schafte hij het lijfeigenschap af en voerde andere regelingen door, die tot verbetering van de positie van vooral mensen op het platteland leidden. De Tsjechen kregen zo meer vrijheden om zichzelf in sociaal en cultureel opzicht te ontplooien. Het Tsjechisch nationalisme stak steeds meer de kop op. In 1792, onder Josefs opvolger Leopold II (1790-1792) werd een leerstoel Tsjechische Taal en Letterkunde opgericht. Het Duits bleef echter de officiële voertaal in de Donaumonarchie. De leidinggevenden spraken Duits, mensen uit de sociaal lagere klassen spraken Tsjechisch.

Ook economisch gezien onderging het land vele veranderingen. De industriële ontwikkelingen kwamen net als in de rest van Europa sterk op gang. Vooral in Bohemen kwam de industrie tot bloei. Op 2 december 1805 werden keizer Franz II (1792-1835) en de Russische tsaar Alexander I door Napoleon Bonaparte in de Driekeizerslag bij Austerlitz (het huidige Slavkov u Brna in Moravië) verslagen. In 1806 hield het Heilige Roomse Duitse Rijk op te bestaan. Franz II noemde zichzelf voortaan Franz I, keizer van Oostenrijk. Bohemen en Moravië behoorden tot dit keizerrijk. Duidelijke veranderingen waren echter niet merkbaar. In 1815 ontstond de Heilige Alliantie, een vredesverbond tussen Oostenrijk, Rusland en Pruisen. Deze alliantie was gespitst op tekens die op een equivalent van de Franse revolutie leken te wijzen. Dit wilde men namelijk te allen tijde tegengaan. In 1848 was het onrustig in heel Europa, ook in Tsjechië. In Praag werd een congres gehouden ter versterking van de Slavische saamhorigheid. De deelnemers werden echter door de Oostenrijkers aangepakt en aan de onlusten werd hardhandig een einde gemaakt. In de eerste regeringsjaren van Franz Josef (1848-1916) verkeerde Tsjechië in een permanente staat van beleg. In grote delen van Europa nam het opkomende liberalisme toe. De Oostenrijkse heersers werden daardoor gedwongen concessies te doen. In 1861 kreeg de Tsjechische partij een zetel in de Oostenrijkse Rijksdag. In 1867 werd het Habsburgse Rijk in twee delen opgesplitst: het Oostenrijkse deel waartoe Bohemen en Moravië behoorden en het Hongaarse deel waaronder Slowakije viel. De keizer/koning benoemde drie ministers voor gemeenschappelijke en buitenlandse zaken. Voor interne aangelegenheden konden de afzonderlijke delen eigen ministers aanstellen. De Oostenrijks-Hongaarse dubbelmonarchie was een feit. De drang tot zelfstandigheid werd onder de Tsjechen echter steeds groter. Het nationaal bewustzijn werd in Bohemen gestimuleerd door schrijvers als Jan Neruda en componisten als Bedrich Smetana.

In 1882 werd de realist Tomáš Masaryk tot minister gekozen. De realisten zagen in dat een zelfstandige Tsjechische staat op dat moment niet echt haalbaar was. Daarom streefden ze in eerste instantie naar een democratische, humanitaire staat binnen de dubbelmonarchie.

In 1914 brak de Eerste Wereldoorlog uit. Directe aanleiding daartoe vormde de moordaanslag op de Oostenrijkse troonopvolger Frans Ferdinand door de Servische student Gavrilo Princip. Tsjechië werd gedwongen de kant van de dubbelmonarchie te kiezen. Dit mocht de Oostenrijkers echter niet baten, zij moesten in 1918 de nederlaag erkennen.