In 1841 arriveerde hij in Zuid-Afrika, vanwaar hij als missionaris noordwaarts trok. Hij kreeg in zuidelijk Afrika grote bekendheid, niet in de eerste plaats als missionaris, maar vooral als arts, wetenschapper en ontdekkingsreiziger. Op grond van humanitaire overwegingen werd hij een gevreesd tegenstander van ieder die iets met de slavernij te maken had. Omdat hij zijn afschuw niet onder stoelen of banken stak, kon hij geen gebruikmaken van de bescherming die reguliere karavanen boden, omdat deze vaak vergezeld werden door slavendrijvers en hun ‘handel’. Zijn reizen duurden dan ook allemaal langer en verliepen allemaal moeizamer.

Zijn eerste grote tocht maakte hij in 1853. Hij verbleef drie jaar in de binnenlanden waar hij o.a. in 1855 op de grens van Zambia en Zimbabwe als eerste blanke de Victoria watervallen bezocht. Als nationale held keerde hij in 1856 naar Londen terug, waar hij van de Royal Geographical Society de gouden medaille van verdienste kreeg. Het stadsbestuur van Londen benoemde hem tot ereburger.

Twee jaar later keerde hij naar Afrika terug om in opdracht van en gesubsidieerd door de Britse regering te zoeken naar de bronnen van de Nijl. Gedurende lange tijd werd niets van hem vernomen en het gerucht ontstond dat hij dood was. Uit publicitaire overwegingen stuurde James Gordon Bennett, hoofdredacteur van de New York Herald, een van zijn journalisten, Henry Morton Stanley naar Afrika met de opdracht uit te vinden wat er met de onderzoeker van wereldfaam was gebeurd. Stanley volgde het spoor van Livingstone en vond hem na een barre tocht in Ujiji, een klein plaatsje aan de oever van Lake Tanganyika nabij Kigoma. Het was hier dat hij de gevleugelde woorden sprak: ‘Dr. Livingstone I presume?’ (‘Dr. Livingstone, mag ik aannemen?’).

Stanley kwam precies op tijd om de kinine voorraad van Livingstone aan te vullen, noodzakelijk om zich tegen malaria te beschermen. Stanley en Livingstone reisden enige tijd samen door het land. Livingstone weigerde naar Engeland terug te keren zolang hij de bronnen van de Nijl niet gevonden had. In 1872 trok hij opnieuw het land in, ditmaal vanuit Tabora in Centraal-Tanzania. Stanley reisde terug naar de kust, met de aantekeningen van Livingstone op zak. Daaruit bleek nog eens extra hoezeer Livingstone overal waar hij kwam ten strijde trok tegen de honger, de ziekten en vooral tegen de slavernij. Hij was vóór kolonisatie omdat naar zijn overtuiging, alleen de komst van de westerse beschaving een einde aan de slavernij zou kunnen maken.

Livingstone richtte zijn aandacht opnieuw op de oevers en het achterland van Lake Tanganyika, omdat hij, nét als Burton, ervan overtuigd was dat de Nijl daar zijn oorsprong moest hebben. Tijdens die reis kwam hij terecht in Chitambos in het huidige Zambia. Ziek en uitgeput overleed hij daar onder een boom op 1 mei 1873. Zijn bedienden, Susi en Chumah balsemden zijn lichaam. Het verhaal gaat dat ze Livingstones hart verwijderden en het begroeven onder de boom waar hij gestorven was. Ter plaatse is later een gedenkteken geplaatst. Ze droegen het geprepareerde lichaam met gevaar voor eigen leven naar Bagamoyo, ruim 1500 kilometer oostwaarts, vanwaar het, via Zanzibar, naar Engeland werd verscheept, ironisch genoeg via dezelfde route als die welke vele slaven aflegden. De stoffelijke resten van Livingstone werden bijgezet in de Westminster Abbey. Susi en Chumah werden door de Britse gouverneur voor hun inspanningen beloond en kregen o.a. een gouden medaille van verdienste.

Stanley keerde terug naar Afrika waar hij vanuit Bagamoyo Livingstones werk probeerde voort te zetten. Hij drong diep in Afrika door, maar onderschreef uiteindelijk de stelling van Speke dat de bronnen van de Nijl zich bevonden bij de Ripon watervallen die vanuit Lake Victoria het water naar de Middellandse Zee voeren.