Pas na de opstand van Manco Inca in 1537 moesten de Aymara-groeperingen kiezen tussen de Inca’s en de Spanjaarden. De Lupaca steunde de Inca-opstand en zond vele krijgers uit. De Collas waren echter pro-Spaans en het gevolg was een gecombineerde Inca- en Lupaca-aanval op de Collas. Herman Pizarro kwam in 1538 de Collas te hulp en versloeg de Lupaca en de Inca-rebellen. Hier besloot Pizarro tot de volledige kolonisatie van de Boliviaanse hooglanden en de valleien, wat uiteindelijk Charcas of Alto Perú genoemd zou worden. In datzelfde jaar werd de stad La Plata (Sucre) gesticht als de Spaanse hoofdstad van de Charcasregio. Pizarro zelf ging weer terug naar Cusco en werd drie jaar later vermoord door aanhangers van Diego de Almagro, maar zijn twee broers Hernando en Gonzalo Pizarro stichtten aan het eind van 1538 de nederzettingen Chuquisaca (nu Sucre) en Porco (regio met mijnen). Pas in 1544 ontdekten mijnwerkers bij Porco de grootste zilverader van het continent, Cerro Rico (rijke berg) en werd hier een jaar later Potosí gesticht. Potosí groeide spectaculair. Het zilver trok lieden vanuit de hele wereld aan. Luxegoederen uit Europa werden geïmporteerd en er werden in de loop van tijd 32 kerken en mooie koloniale huizen en paleizen gebouwd. De Spanjaarden zagen het belang van Potosí in en richtten daarom drie jaar later de Casa de la Moneda (de Munt) op, die tijdens de beginjaren de administratie van de transacties, de arbeiders en financiën voor de Spaanse Kroon ging beheren. De opbrengsten van de zilvermijnen zouden de Spaanse economie voor lange tijd ondersteunen en hun oorlogen financieren. Dit ten koste van miljoenen inheemse mijnwerkers, die in de mijnen stierven aan Europese ziektes zoals pokken en griep, mishandeling en uitputting. Diverse regio’s in Bolivia profiteerden van de spectaculaire economische groei van Potosí. In 1548 werd La Paz gesticht dat zich door zijn geografische ligging al gauw transformeerde in een belangrijk commercieel en transportcentrum op de ‘zilverroute’ Potosí-La Paz-Cusco-Lima of de route via de zeehaven van Arica. Ook bezat het een grote landbouwmarkt waar de producten uit de Altiplano en de valleien van de Yungas aangeboden werden. Daarnaast groeide de vraag naar cocabladeren uit de Yungas. De cocabladerenhandel werd gecontroleerd door Aymara uit de Altiplano. Zij haalden zwarte slaven naar de Yungas om te werken als landarbeiders. De Spanjaarden wilden coca voor de mijnwerkers aangezien dit een goed middel tegen hoogteziekte was (Potosí lag op 4000 m hoogte) en bovendien nam coca het hongergevoel en vermoeidheid weg. De Tucumanregio in Argentinië zorgde voor de levering van muilezels, wijn en suiker aan Potosí. Tarija, dat tussen Tucuman en Potosí lag werd door zijn vruchtbare grond en gunstige klimaat een belangrijke wijnstreek. Cochabamba werd in 1574 gesticht en zijn vruchtbare vallei was van groot belang voor de voedselvoorziening van Potosí. Spaanse kolonisten kochten dit land op en startten er een haciënda.

Kolonisatie van het oosten van Bolivia

Naast de Spaanse verovering via Peru vond ook een verovering plaats vanaf Río de la Plata aan de Atlantische Oceaan (nu Argentinië). In 1535 werd de havenstad Asunción aan de Paraguayrivier gesticht en drongen Spaanse kolonisten verder naar het westen door en staken de uitgestrekte steppe van El Chaco over. Rond 1540 stichtten zij permanent bewoonde posten in de Chiquitos en Mojos regio’s. Zij werden echter door ondernemers van Lima en Cusco gestopt in hun expansiedrang naar het westen en na enige expedities stichtten zij in 1561 met behulp van troepen uit Paraguay de nederzetting Santa Cruz de la Sierra. Vanuit hier begonnen de kolonisten tussen 1580 en 1617 hun zoektocht naar El Dorado (Goudland) waar de Inca’s hun goudschatten verborgen zouden hebben. De expedities kwamen echter op hun weg door de savanne vijandige inheemse stammen tegen en moesten uiteindelijk hun zoektocht opgeven.